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免疫熒光技術指南—冰凍切片制備
發表者:北京博奧森生物      發表時間:2019-6-28

免疫熒光技術簡介

      免疫熒光技術是基于熒光基團被特定波長的光激發后發射波長較長的熒光的特性,通過熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等儀器的檢測,達到定位、示蹤、含量測定等目的,并廣泛應用于多個研究領域。熒光染料可以與一抗或二抗直接偶聯,也可與鏈霉素親和素偶聯。主要特點:特異性強,敏感度高,速度快,可進行亞細胞定位的精細觀察,可以一次檢測多種抗原。

免疫熒光工作原理




樣本的制備

      熒光抗體技術主要依靠觀察切片標本上熒光抗體的染色結果作為抗原的鑒定,因此標本制作的好壞直接影響檢測的結果;在制作標本過程中應力求保持抗原的完整性,并在染色、洗滌和包埋過程中不發生溶解和變性,也不擴散至臨近細胞或組織間隙中去;標本切片要盡量薄,以利于抗原抗體接觸和鏡檢。


石蠟切片與冰凍切片的對比


冰凍切片制備要點

       冰凍切片由于其可以較好的保留酶功能和抗原性,從而廣泛的應用于免疫熒光檢測中,并且我們通常會在檢測一些翻譯后修飾的抗原時應用到它,由于其常采用丙酮進行固定,此類固定劑通常不會掩蔽抗原表位,所以不需要像甲醛固定的石蠟切片必須進行抗原修復,從而減去了冗長的實驗步驟,也減少了實驗失敗的幾率。

       冰凍切片的質量與實驗成敗息息相關,高質量的切片可以避免實驗中組織脫片,減少組織細胞形態的損壞,大大提高了實驗結果的可信度。我們要從實驗取材開始就做正確的處理方式,盡量減少人為因素對實驗結果造成的不確定性。

1.選取組織
      盡量使用新鮮取材的組織,以使抗原較好的保存下來,降低凍存幾率從而減少組織內冰晶的產生;離體組織最好直接進行切片,將組織放在樣品托上,滴加OCT包埋劑,選擇合適的溫度在冰凍切片機中冷凍30min以上,具體時間根據組織大小而定,要保證組織冷凍均勻,不宜時間過長。時間過長,組織會因過度冷凍開裂而導致切片失敗。
2.制片及常見問題
     不同組織所需切片溫度不同,要選擇最適溫度才能獲得高質量的冰凍切片。冷凍溫度通常在-10℃至-25℃左右,所需溫度:心、腎、胃、腸<腦、脾、肌肉。
     切片時一定要保持勻速,切片要平整不能皺縮,其厚度通常為7μm。粘片時應平行的將涂有粘片劑的載玻片貼近組織切片,不要從一側慢慢地將組織切片吸附到載玻片上,這樣會影響組織細胞形態。

3.固定及保存

制備好的切片室溫放置1 h,晾干后-20℃丙酮中固定20min,切片可以在4℃條件下保存一個月左右,-20℃保存可以適當延長保存時間;建議盡快使用。

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